Εντοπίστε το παράσιτο Nosema στον σωστό χρόνο για να σώσετε τις αποικίες των μελισσών
Γράφει η Katherine Aronstein, ερευνητική μοριακή βιολόγος, USDA / ARS
Όσοι από εμάς δουλεύουμε με μέλισσες γνωρισαμε σημαντικές αλλαγές στις μελισσοκομικές πρακτικές τα τελευταία χρόνια. Φαίνεται ότι οι δυσκολίες διατήρησης των μελισσών έχουν μεταμορφώσει τη διαχείριση ρουτίνας σε έναν επικό αγώνα για την επιβίωση των αποικιών. Ορισμένα από τα προβλήματα μπορούν να εξηγηθούν με την εισαγωγή και διάδοση νέων ασθενειών και μικροβίων που έχουν καταστεί ανθεκτικά στις φαρμακευτικές αγωγές. Πρόσφατα περιγράψαμε έναν από αυτούς τους μηχανισμούς αντοχής στα φάρμακα στα βακτήρια AFB (Murray and Aronstein, 2006). Η αυξημένη χρήση συνθετικών εντομοκτόνων εντός και εκτός των κυψελών δεν βοήθησε. Συνδυασμοί διαφορετικών φυτοφαρμάκων (ακόμη και όταν δεν είναι ιδιαίτερα τοξικά για τις μέλισσες όταν χρησιμοποιούνται μόνοι τους) μπορεί να προκαλέσουν ακούσια αποτελέσματα επηρεάζοντας τη συνολική υγεία και την ανοσολογική αντίδραση των μελισσών.
Απειλούμενο με την απώλεια βασικών επικονιαστών, το Κογκρέσο των ΗΠΑ έχει εγκρίνει αυξημένα επίπεδα χρηματοδότησης της έρευνας για τα μέλισσα για να ανακαλύψουν και να μετριάσουν τα αίτια της μείωσης των μελισσών. Μήπως οι μέλισσες βιώνουν την επίδραση ενός νέου παράγοντα που δεν έχει προσδιοριστεί (π.χ. ασθένεια, φυτοφάρμακο κ.λπ.) ή είναι αυτό το ίδιο παλιό πρόβλημα που δείχνει τις άσχημες και υπερβολικές μορφές του; Το πρόβλημα αυτό αποτελεί σήμερα το επίκεντρο πολλών ερευνών. Οι επιστήμονες εξετάζουν τη βασική αιτία του συνδρόμου της κατάρρευσης της αποικίας (CCD), ψάχνοντας για νέες ασθένειες, επιβλαβείς χημικές ουσίες ή έναν συνδυασμό αυτών των παραγόντων που θα μπορούσαν να προκαλέσουν άγχος στις αποικίες των μελισσών, ωθώντας τους πάνω από την άκρη για ανάκαμψη. Πολλά από αυτά τα επείγοντα ζητήματα θα εξεταστούν στο νέο πολυεθνικό γεωργικό πρόγραμμα συντονισμού USDA, μέσω της συστηματικής ανάλυσης των μελισσών,
Μεταξύ των πολλαπλών υπόπτων που έχουν εντοπιστεί μέχρι στιγμής, οι ιοί μελισσών και το μικροσκοπικό παράσιτο Nosema έχουν προσελκύσει την μεγαλύτερη προσοχή στον Τύπο και δικαίως. Τα περισσότερα από αυτά είναι ενδοκυτταρικά παράσιτα τα οποία δεν είναι ανιχνεύσιμα με εξέταση οπτικής αποικίας. Όταν οι μέλισσες εμφανίζουν επιτέλους σημάδι της νόσου, είναι κατά το μεγαλύτερο μέρος πολύ αργά για να σώσουν την αποικία, καθώς οι περισσότερες μέλισσες μολύνονται και πεθαίνουν.
Το Nosema apis είναι γνωστό ότι εμφανίζεται στις Ηνωμένες Πολιτείες τουλάχιστον από τη δεκαετία του 1950, αλλά η παρουσία του στις μέλισσες είναι θέμα μικτής ανησυχίας. Όταν βρέθηκαν μολυσμένες μέλισσες μπροστά από τις αποικίες που άφησαν κίτρινες κηλίδες διάρροιας, κανονικά υποβλήθηκαν σε αγωγή με αντιβιοτικά (Higes et al., 2009) και αυτό το πρόβλημα αντιμετωπιστικε. Τότε γιατί οι επιστήμονες υποψιάζονται τώρα το Nosema στις πρόσφατες απώλειες των μελισσών; Μερικοί επιστήμονες μάλιστα επισημαίνουν το Nosema ως κύριο λόγο για το CCD (Higes et al., 2009). Προφανώς, ένα νέο είδος Nosema ( N. ceranae ) είναι πλέον ευρέως διαδεδομένο στις ΗΠΑ και σε όλο τον κόσμο, αντικαθιστώντας σιωπηλά τον Ν. Apis.
Από την ανακάλυψη αυτή σημειώθηκε ελάχιστα το 1996. Αλλά η ανησυχία αναζωπυρώθηκε το 2005 όταν παρατηρήθηκαν οι ασθένειες στην Ασία που πάσχουν από την ασθένεια. Το 2006 Η N. ceranae ανιχνεύθηκε στην Ευρώπη προκαλώντας μεγάλες απώλειες αποικιών στην Ισπανία, τη Γαλλία, τη Γερμανία και την Ελβετία (Higes, et al., 2006). Δεδομένου ότι αυτό το νέο είδος δεν είναι άμεσα ανιχνεύσιμο στο μελισσοκομείο, η μόλυνση παραμένει απαρατήρητη για μεγάλο χρονικό διάστημα. Οι μέλισσες θα μπορούσαν να μολυνθούν για εβδομάδες και να μην παρουσιάσουν κλινικά συμπτώματα της νόσου.
Η μικροσκοπική ταυτοποίηση αυτού του νέου είδους είναι επίσης μια πρόκληση καθώς και οι δύο Ν. Apis και N. ceranae. Τα σπόρια φαίνονται παρόμοια όταν παρατηρούνται κάτω από μικροσκόπιο. Επομένως, για την ταυτοποίηση των ειδών, τα δείγματα των μελισσών αποστέλλονται κανονικά σε ένα εργαστήριο ικανό να ενισχύσει το DNA. Στο εργαστήριο, οι επιστήμονες μπορούν να προσδιορίσουν τις γενετικές διαφορές μεταξύ των δύο ειδών του Nosema χρησιμοποιώντας PCR. Δεδομένου ότι οι μολυσμένες με N. ceranae αποικίες μπορούν να πεθάνουν πολύ πιο γρήγορα, η επιβίωση των αποικιών εξαρτάται από την έγκαιρη ανίχνευση και θεραπεία της ασθένειας. Ωστόσο, ο πολύτιμος χρόνος χάνεται περιμένοντας τα εργαστηριακά αποτελέσματα. Επομένως, η ανάπτυξη ενός γρήγορου και απλού εργαλείου αναγνώρισης θα μπορούσε να σώσει ένα ολόκληρο μελισσοκομείο και να αποτρέψει επιδημίες ασθενειών.
Δοκιμή ζυμών
Η ιδέα πίσω από αυτό το εργαλείο δεν είναι νέα, βασίζεται στις αρχές της ανοσολογίας (αλληλεπίδραση αντισώματος-πρωτεΐνης). Το εργαλείο συχνά σχεδιάζεται σε μορφή λαδιού για εύκολη χρήση στο πεδίο ή στο σπίτι. Παρόλο που οι δοκιμές μέτρησης με βάση τα αντισώματα περιλαμβάνουν εξελιγμένη τεχνολογία που προκύπτει από έρευνα και ανάπτυξη, τα πραγματικά προϊόντα είναι φιλικά προς το χρήστη και συσκευάζονται ως κιτ αντιδραστηρίων. Τέτοιες μέθοδοι έχουν αναπτυχθεί για την ανίχνευση ιατρικά σημαντικών ασθενειών και των εντόμων τους και την ανίχνευση του Ηΐν στο ανθρώπινο αίμα. Ίσως η πιο γνωστή χρήση είναι η τεστ εγκυμοσύνης στο σπίτι.
Με την προσαρμογή αυτής της τεχνολογίας στις ανάγκες μελισσοκομίας, θα είναι δυνατή η ανάπτυξη μιας απλής και χωρίς σφάλματα μεθόδου για την ανίχνευση της λοίμωξης Nosema στα δείγματα των μελισσών. Αυτή η έρευνα διεξάγεται αυτή τη στιγμή στη Μονάδα Έρευνας Μέλισσας Μέλισσας Weslaco (USDA / ARS) στο πλαίσιο του σχεδίου ΚΓΠ. Το τελικό προϊόν, μια δοκιμασία μέτρησης λαδιού για την ανίχνευση σπορίων Nosema στα δείγματα των μελισσών, θα αναπτυχθεί σε συνεργασία με ιδιωτικές εταιρείες βιοτεχνολογίας. Ορισμένες από τις εταιρείες έχουν ήδη λάβει την πρότασή μας.
Σχήμα 1. Πώς λειτουργεί η δοκιμή
1 (A). Μια λωρίδα κυτταρίνης εισάγεται σε ένα φιαλίδιο γεμάτο με ένα μείγμα αντιδραστηρίου (παρέχεται) και ομογενοποιημένο έντερο μελισσών. Λίγα λεπτά αργότερα, στη λωρίδα κυτταρίνης θα εμφανιστούν χρωματικές ζώνες (-), οι οποίες θα δείχνουν (-) αρνητικό αποτέλεσμα εάν είναι ορατή μόνο μια κατώτερη ζώνη (έλεγχος) και (+) θετικό αποτέλεσμα όταν είναι ορατές δύο ζώνες.
1 (Β). Σχηματική παρουσίαση της ανοσολογικής αντίδρασης. Nosema ceranaeΑντισώματα (Ab) ενσωματώνονται σε λωρίδα κυτταρίνης και χρησιμεύουν ως "κόκκινη σημαία" και άγκυρα για το ανοσογόνο (πρωτεΐνη Nosema). Η ανοσολογική αντίδραση βασίζεται σε έναν πολύ ισχυρό δεσμό που αναπτύσσεται μεταξύ του Nosema Ab και της πρωτεΐνης Nosema που αρχικά χρησιμοποιήθηκε για την ανάπτυξη του Ab. Όταν τα σπόρια Nosema προστίθενται στο μείγμα αντίδρασης, το Ab θα δεσμεύεται με την πρωτεΐνη Nosema και θα σχηματίζει έναν πολύ ισχυρό δεσμό. Εάν η αντίδραση αυτή συσχετίζεται με ανίχνευση χρώματος χρησιμοποιώντας δευτερογενή αντισώματα (ανιχνευτής Ab), η εμφάνιση δύο χρωστικών ζωνών (έλεγχος και Nosema-specific) υποδεικνύει την παρουσία σπορίων Nosema. Η εμφάνιση μιας μονής ζώνης χρώματος (ελέγχου) υποδηλώνει αρνητικό αποτέλεσμα.
1 (A). Μια λωρίδα κυτταρίνης εισάγεται σε ένα φιαλίδιο γεμάτο με ένα μείγμα αντιδραστηρίου (παρέχεται) και ομογενοποιημένο έντερο μελισσών. Λίγα λεπτά αργότερα, στη λωρίδα κυτταρίνης θα εμφανιστούν χρωματικές ζώνες (-), οι οποίες θα δείχνουν (-) αρνητικό αποτέλεσμα εάν είναι ορατή μόνο μια κατώτερη ζώνη (έλεγχος) και (+) θετικό αποτέλεσμα όταν είναι ορατές δύο ζώνες.
1 (Β). Σχηματική παρουσίαση της ανοσολογικής αντίδρασης. Nosema ceranaeΑντισώματα (Ab) ενσωματώνονται σε λωρίδα κυτταρίνης και χρησιμεύουν ως "κόκκινη σημαία" και άγκυρα για το ανοσογόνο (πρωτεΐνη Nosema). Η ανοσολογική αντίδραση βασίζεται σε έναν πολύ ισχυρό δεσμό που αναπτύσσεται μεταξύ του Nosema Ab και της πρωτεΐνης Nosema που αρχικά χρησιμοποιήθηκε για την ανάπτυξη του Ab. Όταν τα σπόρια Nosema προστίθενται στο μείγμα αντίδρασης, το Ab θα δεσμεύεται με την πρωτεΐνη Nosema και θα σχηματίζει έναν πολύ ισχυρό δεσμό. Εάν η αντίδραση αυτή συσχετίζεται με ανίχνευση χρώματος χρησιμοποιώντας δευτερογενή αντισώματα (ανιχνευτής Ab), η εμφάνιση δύο χρωστικών ζωνών (έλεγχος και Nosema-specific) υποδεικνύει την παρουσία σπορίων Nosema. Η εμφάνιση μιας μονής ζώνης χρώματος (ελέγχου) υποδηλώνει αρνητικό αποτέλεσμα.
Πώς λειτουργεί;
Ένα κιτ θα περιέχει πολλαπλές λωρίδες κυτταρίνης, καθένα από τα οποία προορίζεται για μία μόνο χρήση. Μετά τη σύνθλιψη μιας μέλισσας ή των αποκομμένων εντέρων από αρκετές μέλισσες σε ένα φιαλίδιο με αντιδραστήριο, μια ταινία κυτταρίνης εισάγεται στο ομογενοποίημα. Λίγα λεπτά αργότερα, θα εμφανιστεί είτε μία είτε μία διπλή μπάντα. Ένα αρνητικό αποτέλεσμα υποδεικνύεται εάν είναι ορατή μόνο μία μπλε ζώνη (έλεγχος) (βλέπε (-), σχήμα 1Α). Ένα θετικό αποτέλεσμα υποδεικνύεται αν είναι ορατές δύο ζώνες, ένα μπλε για τον έλεγχο και το άλλο κόκκινο που υποδεικνύει την πρωτεΐνη Nosema στόχου (βλέπε (+), Εικόνα 1Α).
Τα αντισώματα Nosema ceranae (Ab) ενσωματώνονται στην ταινία κυτταρίνης και χρησιμεύουν ως «κόκκινη σημαία» και μια άγκυρα για το ανοσογόνο (μια πρωτεΐνη Nosema). Η ανοσολογική αντίδραση βασίζεται σε έναν πολύ ισχυρό δεσμό που αναπτύσσεται μεταξύ του Nosema Ab και της πρωτεΐνης Nosema που αρχικά χρησιμοποιήθηκε για την ανάπτυξη αυτού του Ab (Σχήμα 1Β). Όταν τα σπόρια Nosema προστίθενται στο μείγμα αντίδρασης, το Ab θα δεσμεύεται με την πρωτεΐνη Nosema και θα σχηματίζει έναν πολύ ισχυρό δεσμό. Εάν η αντίδραση αυτή συσχετίζεται με ανίχνευση χρώματος χρησιμοποιώντας δευτερεύοντα αντισώματα (ανιχνευτής Ab), η εμφάνιση δύο χρωστικών ζωνών (ελέγχου και Nosema-specific) υποδεικνύει την παρουσία σπορίων Nosema. Η εμφάνιση μιας μονής ζώνης χρωμάτων (έλεγχος) υποδεικνύει αρνητικά αποτελέσματα.
Δεδομένου ότι η βασική ιδέα πίσω από τη δοκιμασία δεν είναι νέα, πολλοί μπροστά μας έχουν προσπαθήσει να αναπτύξουν τέτοιες δοκιμές. Ωστόσο, η κακή ποιότητα των αντισωμάτων, η έλλειψη εξειδίκευσης και το χαμηλό επίπεδο ευαισθησίας είναι οι κύριες δυσκολίες που εμπόδισαν την επιτυχή ανάπτυξη ενός γρήγορου τεστ. Τα αντισώματα παράγονται συνήθως με έγχυση μιας ξένης πρωτεΐνης (ανοσογόνο) σε ζώα όπως αιγοειδή, κουνέλια, αρουραίοι ή ποντίκια. Το ανοσοποιητικό σύστημα των ζώων ανιχνεύει έπειτα μια ξένη εισβολή και αποκρίνεται με την παραγωγή αντισωμάτων. Σαφώς, η ποιότητα των αντισωμάτων μπορεί να κάνει μια ανοσολογική δοκιμασία επιτυχία ή αποτυχία. Το πόσο καλά τα αντισώματα ανιχνεύουν το αρχικό ανοσογόνο εξαρτάται από τον τύπο και την καθαρότητά του.
Σχήμα 2. Πώς παράγονται τα αντισώματα
Χρησιμοποιώντας την τεχνολογία GAT, εισάγεται στο ζώο ένα κυκλικό κομμάτι DNA (πλασμίδιο) που περιέχει την αλληλουχία DNA που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη που μας ενδιαφέρει. Στη συνέχεια παράγεται καθαρή πρωτεΐνη απευθείας στο ζώο (και στο ζώο), παρακάμπτοντας έτσι τη διαδικασία παραγωγής κανονικής μακράς πρωτεΐνης στο εργαστήριο. Η ίη νίνο εκφρασμένη πρωτεΐνη αναγνωρίζεται από το ζώο ως ξένος εισβολέας ο οποίος με τη σειρά του ενεργοποιεί την παραγωγή και απελευθέρωση αντισωμάτων στο αίμα του ζώου. Τα αντισώματα στη συνέχεια καθαρίστηκαν και χρησιμοποιήθηκαν στις δοκιμές ανίχνευσης Nosema.
Χρησιμοποιώντας την τεχνολογία GAT, εισάγεται στο ζώο ένα κυκλικό κομμάτι DNA (πλασμίδιο) που περιέχει την αλληλουχία DNA που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη που μας ενδιαφέρει. Στη συνέχεια παράγεται καθαρή πρωτεΐνη απευθείας στο ζώο (και στο ζώο), παρακάμπτοντας έτσι τη διαδικασία παραγωγής κανονικής μακράς πρωτεΐνης στο εργαστήριο. Η ίη νίνο εκφρασμένη πρωτεΐνη αναγνωρίζεται από το ζώο ως ξένος εισβολέας ο οποίος με τη σειρά του ενεργοποιεί την παραγωγή και απελευθέρωση αντισωμάτων στο αίμα του ζώου. Τα αντισώματα στη συνέχεια καθαρίστηκαν και χρησιμοποιήθηκαν στις δοκιμές ανίχνευσης Nosema.
Όταν παράγεται ανοσογόνο στο εργαστήριο, ο χρόνος, η προσπάθεια και οι πόροι που απαιτούνται για τη σύνθεσή του μπορεί να είναι σημαντικοί. Είναι πρόκληση να γίνει ένα καθαρό ανοσογόνο. Τα μόρια μόλυνσης μπορούν να χρησιμεύσουν ως δευτερογενή ανοσογόνα, οδηγώντας σε αντισώματα που δεν έχουν εξειδίκευση. Αποφασίσαμε να αποφύγουμε αυτό το λάθος επιλέγοντας έναν νέο τρόπο ανάπτυξης των αντισωμάτων, της αποκαλούμενης τεχνολογίας γονιδιωματικών αντισωμάτων (GAT) (Εικόνα 2). Η χρήση αυτής της τεχνολογίας είναι ένας εντελώς νέος τρόπος σκέψης για τα ανοσογόνα. Χρησιμοποιώντας την τεχνολογία GAT, εγχύεται στο ζώο ένα κομμάτι κυκλικού DNA (πλασμίδιο) που περιέχει την αλληλουχία DNA που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη που μας ενδιαφέρει (Nosema στην περίπτωσή μας). Στη συνέχεια παράγεται καθαρή πρωτεΐνη απευθείας στο ζώο (και στο ζώο), παρακάμπτοντας έτσι τη διαδικασία παραγωγής κανονικής μακράς πρωτεΐνης στο εργαστήριο.
Μία δυσκολία στη χρήση της τεχνολογίας GAT είναι ότι απαιτεί προηγούμενη γνώση των πρωτεϊνικών αλληλουχιών. Αυτό είναι ένα σοβαρό εμπόδιο εκτός εάν έχει γίνει αλληλουχία του γονιδιώματος του παθογόνου. Ευτυχώς, και τα δύο γονιδιώματα Nosema ακολουθούνται από το USDA. Είχαμε τη δυνατότητα να αναγνωρίσουμε μια αλληλουχία πρωτεϊνών στόχου που βρίσκεται στο τοίχωμα των σπορίων Nosema ceranae (η αλληλουχία DNA παρέχεται με την ευγένεια του Dr. Jay Evans, Ερευνητικό Εργαστήριο Μέλισσας Μέλισσας Beltsville, USDA / ARS). Τώρα δοκιμάζουμε το νέο μας ceranae NosemaΑντισώματα σε δείγματα μέλισσας. Μέχρι στιγμής, οι δοκιμές μας δείχνουν υψηλή ευαισθησία Ab που μπορεί να ανιχνεύσει σπόρια Nosema σε ακατέργαστα ομογενοποιήματα μελισσών σε αραίωση 1: 5000, παρόμοια με τα εμπορικά παραγόμενα Abs. Δοκιμάζουμε επίσης την ελάχιστη ποσότητα σπορίων που μπορεί να ανιχνευθεί από τη δοκιμή. Χρησιμοποιώντας εργαστηριακές μεθόδους ρουτίνας βασισμένες σε πήκτωμα, διαπιστώσαμε ότι το νέο μας Abs μπορεί να ανιχνεύσει μία μολυσμένη μέλισσα ανάμεσα σε χίλιες μη μολυσμένες μέλισσες. Αυτό το επίπεδο ευαισθησίας θα επιτρέψει την ανίχνευση πολύ χαμηλών ποσοστών μόλυνσης στις αποικίες μελισσών.
Ποιος θα μπορέσει να χρησιμοποιήσει αυτό το τεστ;
Η δοκιμή δεν προορίζεται να αντικαταστήσει τις τρέχουσες μεθόδους που χρησιμοποιούνται στα ερευνητικά εργαστήρια. Δεν υπάρχει ανάγκη αντικατάστασης της τεχνολογίας υψηλής απόδοσης που έχει σχεδιαστεί για την επεξεργασία μεγάλου αριθμού δειγμάτων. Αντ 'αυτού, θα βοηθήσει τους μελισσοκόμους, τους χομπίστες καθώς και τους εμπορικούς μελισσοκόμους να ανιχνεύσουν και να παρακολουθήσουν την εξέλιξη της ασθένειας στον αγρό. Θα βοηθήσει τους μελισσοκόμους να λάβουν εκπαιδευμένες αποφάσεις σχετικά με τη διαχείριση της νόσου. Το πιο καινούριο εργαλείο θα είναι (1) η ενθάρρυνση της μειωμένης χρήσης αντιβιοτικών, καθώς θα αποθαρρύνει τις περιττές θεραπείες, (2) θα δώσει στους ρυθμιστικούς φορείς νέα μέσα λήψης αποφάσεων όσον αφορά το διακρατικό και διεθνές κίνημα των μελισσών και (3) θα παράσχει στους παραγωγούς Τις βασίλισσες και τις μελισσοκομικές συσκευασίες ως μέσο ανίχνευσης και παρακολούθησης των επιπέδων Nosema στις αποικίες παραγωγής τους. Αποποίηση ευθυνών "
Οι παραπομπές αναφέρονται
- Higes, M., Martín, R. και Meana, Α. 2006. Nosema ceranae , ένα νέο μικροσποριδικό παράσιτο σε μέλισσες στην Ευρώπη. Journal of Ασπόνδυλα Παθολογία 92: 93-95
- Η., Higges, Μ., Raquel Martín-Hernández, R., Garrido-Bailón, L.I., González-Porto, AV, Pilar Garcia- Palencia, P., Aranzazu Μ., Del Nozal, Bernal, JL. 2009. Η κατάρρευση της αποικίας των μελισσών εξαιτίας του Nosema ceranae σε επαγγελματικά μελισσοκομεία. Περιβαλλοντικές Μικροβιολογικές Εκθέσεις 1 (2): 1758-2229
- Johnson, RM, HS Pollock και MR Berenbaum. 2009. Συνεργατικές αλληλεπιδράσεις μεταξύ των εντομοκτόνων εντόμων στην Apis mellifera Journal of Economic Entomology 102: 474-479
- Murray, KD and Aronstein, ΚΑ 2006. Ανθεκτικότητα οξυτετρακυκλίνης στο παθογόνο μέλισσας Paenibacillus προνύμφες κωδικοποιούνται στο νέο πλασμίδιο ρΜΑ67. Journal of Apicultural Research 45: 207-214
Μετάφραση Melissocosmos